UNIVERSIDAD CATÓLICA SEDES SAPIENTIAE FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y AMBIENTALES Biorremediación de suelos contaminados con plomo (Pb) empleando Helianthus annuus L. “girasol” en simbiosis con humus de Eisenia foetida “lombriz roja” en Canchaque, Piura TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE INGENIERO AMBIENTAL AUTORES Esther Maribel Litano Chavez Paola Patricia Yarleque Chero ASESOR Jose Luis Sosa Leon Morropón, Perú 2025 Repositorio Institucional METADATOS COMPLEMENTARIOS Datos de los Autores Autor 1 Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Número de Orcid (opcional) Autor 2 Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Número de Orcid (opcional) Autor 3 Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Número de Orcid (opcional) Autor 4 Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Número de Orcid (opcional) Datos de los Asesores Asesor 1 Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Número de Orcid (Obligatorio) Asesor 2 Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Número de Orcid (Obligatorio) Repositorio Institucional Datos del Jurado Presidente del jurado Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Segundo miembro Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Tercer miembro Nombres Apellidos Tipo de documento de identidad Número del documento de identidad Datos de la Obra Materia* Campo del conocimiento OCDE Consultar el listado: Idioma Tipo de trabajo de investigación País de publicación Recurso del cual forma parte Nombre del grado Grado académico o título profesional Nombre del programa Código del programa Consultar el listado: *Ingresar las palabras clave o términos del lenguaje natural (no controladas por un vocabulario o tesauro). (opcional) https://cutt.ly/JFQJ8aQ https://cutt.ly/EFQ4UTY ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS ACTA N° 069-2025-UCSS/FCAA-DI Siendo las 07:30 a. m. del 17 de octubre de 2025 a través de la plataforma virtual zoom de la Universidad Católica Sedes Sapientiae, el Jurado de Tesis integrado por: 1. Katterin Jina Luz Pinedo Gómez presidente 2. Natividad Lourdes Artica Cosme primer miembro 3. Yulissa Verónica Melgar Fernández segundo miembro 4. José Luis Sosa León asesor(a) Se reunieron para la sustentación virtual de la tesis titulada: Biorremediación de suelos contaminados con plomo (Pb) empleando Helianthus annuus L. “girasol” en simbiosis con humus de Eisenia foetida “lombriz roja” en Canchaque, Piura Que presentan las bachilleres en Ciencias Ambientales Esther Maribel Litano Chavez Paola Patricia Yarleque Chero Cumpliendo así con los requerimientos exigidos por el reglamento para la modalidad de titulación; la presentación y sustentación de un trabajo de investigación original, para obtener el Título Profesional de Ingeniero Ambiental. Terminada la sustentación y luego de deliberar, el jurado acuerda: APROBAR X DESAPROBAR … La tesis, con el calificativo de BUENA y eleva la presente acta al decanato de la Facultad de Ciencias Agrarias y Ambientales, a fin de que se declare EXPEDITA para conferir el TÍTULO DE INGENIERO AMBIENTAL. Lima, 17 de octubre de 2025. REPOSITORIO INSTITUCIONAL DIGITAL Anexo 2 CARTA DE CONFORMIDAD DEL ASESOR DE TESIS CON INFORME DE EVALUACIÓN DEL SOFTWARE ANTIPLAGIO Morropón, 12 de noviembre de 2025 Señor(a), Jefe del Departamento de Investigación Facultad de Ciencias Agrarias y Ambientales Reciba un cordial saludo. Sirva el presente para informar que la tesis bajo mi asesoría, con título: “Biorremediación de suelos contaminados con plomo (Pb) empleando Helianthus annuus L. “girasol” en simbiosis con humus de Eisenia foetida “lombriz roja” en Canchaque, Piura, presentado por Esther Maribel Litano Chavez (código de estudiante 2015100109 y DNI 76233941) y Paola Patricia Yarleque Chero (código de estudiante 2015100103 y DNI 75971708) para optar el título profesional de Ingeniería Ambiental, ha sido revisado en su totalidad por mi persona y CONSIDERO que el mismo se encuentra APTO para ser publicado en el Repositorio Institucional Digital. Asimismo, para garantizar la originalidad del documento en mención, se le ha sometido a los mecanismos de control y procedimientos antiplagio previstos en la normativa interna de la Universidad, cuyo resultado alcanzó un porcentaje de similitud de 6%. Por tanto, en mi condición de asesor, firmo la presente carta en señal de conformidad y adjunto el informe de similitud del Sistema Antiplagio Turnitin, como evidencia de lo informado. Sin otro particular, me despido de usted. Atentamente, Firma Jose Luis Sosa Leon DNI N°: 03891414 ORCID: 0000-0001-8149-8063 Facultad de Ciencias Agrarias y Ambientales - UCSS * De conformidad con el artículo 8°, del Capítulo 3 del Reglamento de Control Antiplagio e Integridad Académica para trabajos para optar grados y títulos, aplicación del software antiplagio en la UCSS, se establece lo siguiente: Artículo 8°. Criterios de evaluación de originalidad de los trabajos y aplicación de filtros El porcentaje de similitud aceptado en el informe del software antiplagio para trabajos para optar grados académicos y títulos profesionales, será máximo de veinte por ciento (20%) de su contenido, siempre y cuando no implique copia o indicio de copia. 6 DEDICATORIA A mis padres Juan y Felipa, a mi querida hermana Liliana por sus consejos, amor, entrega y apoyo constante e incondicional, quienes fueron los pilares fundamentales para construir mi vida profesional, a mis hermanos Pedro y Digna por su motivación y ánimos durante los momentos más desafiantes. Gracias familia. Esther A mis padres Saul y Eddy por sus sabios consejos, comprensión y amor, que me han permitido formarme con principios y valores y llegar a ser una buena profesional. A mis hermanas Karla y Génesis por su apoyo incondicional y motivación. Gracias infinitas. Patricia 7 AGRADECIMIENTOS Nos gustaría expresar nuestro más sincero agradecimiento, a quienes nos han acompañado y apoyado a lo largo de este proceso, ya que, sin su colaboración y respaldo, la ejecución de esta investigación no hubiese sido posible. Asimismo, expresamos los más sinceros agradecimientos a nuestro asesor José Luis Sosa León y el Ing. Víctor Manuel Requena Sullón, por su dedicación, orientación y paciencia. Su compromiso y experiencia fueron fundamentales en cada etapa de este trabajo, siempre brindándonos el conocimiento necesario para llevar a cabo esta investigación de manera rigurosa y satisfactoria. A nuestros padres, queremos expresarles un agradecimiento eterno por su infinito e incondicional amor, respaldo permanente y sacrificios a lo largo de nuestras vidas. Su confianza y aliento en todo momento nos han motivado a seguir adelante, especialmente en los momentos más difíciles. Gracias por estar siempre a nuestro lado, proporcionándonos el apoyo emocional y práctico necesario para culminar este proyecto. A nuestros familiares, especialmente a nuestros hermanos, les agradecemos profundamente por su comprensión y apoyo durante este largo proceso. Sabemos que su paciencia y ánimo han sido un pilar fundamental en nuestro camino académico. Finalmente, extendemos nuestra gratitud a todas las personas que contribuyeron significativamente a nuestra formación y desarrollo durante nuestra formación académica. Cada gesto de apoyo, cada consejo y cada palabra de aliento ha sido un estímulo invaluable. 8 ÍNDICE GENERAL Pág. ÍNDICE GENERAL .............................................................................................................. 8 ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................... 11 ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... 12 ÍNDICE DE APÉNDICES .................................................................................................. 13 RESUMEN .......................................................................................................................... 14 ABSTRACT ........................................................................................................................ 15 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 16 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 19 CAPÍTULO I: MARCO TEÓRICO .................................................................................... 20 1.1. Antecedentes .............................................................................................................. 20 1.2. Bases teóricas especializadas ..................................................................................... 26 1.2.1. Contaminación del suelo ............................................................................................ 26 1.2.2. Biorremediación ......................................................................................................... 29 1.2.3. Fitorremediación ........................................................................................................ 31 1.2.4. Girasol ........................................................................................................................ 33 1.2.5. Lombriz Eisenia foetida ............................................................................................. 34 1.2.6. Simbiosis .................................................................................................................... 36 CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................. 37 2.1. Diseño de la investigación ......................................................................................... 37 2.2. Lugar y fecha.............................................................................................................. 37 2.3. Descripción del experimento...................................................................................... 40 2.3.1. Caracterizar las propiedades del suelo (pH, temperatura, conductividad eléctrica y humedad), y la concentración de plomo inicial ......................................................... 40 2.3.2. Estudiar algunas de las propiedades fisicoquímicas de H. annuus (altura de la planta, crecimiento de raíz, cantidad de hojas y concentración final de Pb) y del sustrato experimental (NPK, textura, capacidad de intercambio catiónico, conductividad eléctrica y pH) de los tratamientos ............................................................................. 40 2.3.3. Evaluar la eficiencia de la biorremediación del suelo contaminado con Pb empleando H. annuus y humus de E. foetida de los tratamientos en estudio ............................... 41 9 2.3.4. Determinar el porcentaje de reducción de Pb que tiene el suelo del tratamiento con mayor efectividad de biorremediación ....................................................................... 41 2.3.5. Fase de muestreo ........................................................................................................ 43 2.3.6. Fase experimental y laboratorio ................................................................................. 46 2.3.7. Fase de gabinete ......................................................................................................... 47 2.4. Tratamientos ............................................................................................................... 48 2.5. Unidades experimentales ........................................................................................... 49 2.6. Identificación de las variables y su mensuración ....................................................... 49 2.7. Diseño estadístico del experimento ............................................................................ 50 2.8. Análisis estadístico de los datos ................................................................................. 51 2.9. Materiales y equipos .................................................................................................. 51 CAPÍTULO III: RESULTADOS ........................................................................................ 54 3.1. Caracterizar las propiedades del suelo (pH, temperatura, conductividad eléctrica y humedad) y concentración de plomo inicial .............................................................. 54 3.2. Estudiar algunas de las propiedades fisicoquímicas de H. annuus y suelo experimental de los tratamientos en estudio .............................................................. 54 3.2.1. Propiedades fisicoquímicas de H. annuus .................................................................. 54 3.2.2. Propiedades fisicoquímicas del suelo experimental ................................................... 56 3.2.3. Textura del suelo ........................................................................................................ 57 3.2.4. Nutrientes del suelo N, P2O5, K2O ............................................................................. 58 3.3. Evaluar la eficiencia de la biorremediación del suelo contaminado con Pb empleando H. annuus y humus de E. foetida de los tratamientos en estudio ............................... 58 3.3.1. Suelo ........................................................................................................................... 58 3.3.2. Tallos .......................................................................................................................... 61 3.3.3. Hojas .......................................................................................................................... 63 3.3.4. Raíces ......................................................................................................................... 66 3.4. Determinar el porcentaje de reducción de Pb que tiene el suelo del tratamiento con mayor efectividad de biorremediación ....................................................................... 68 CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN ............................................................................................. 70 4.1. Caracterizar las propiedades del suelo (pH, temperatura, conductividad eléctrica y humedad), y la concentración de plomo inicial ......................................................... 70 4.2. Estudiar algunas de las propiedades fisicoquímicas de H. annuus y suelo experimental de los tratamientos en estudio .............................................................. 71 4.2.1. Propiedades físicas de H. annuus ............................................................................... 71 10 4.2.2. Propiedades fisicoquímicas del suelo experimental ................................................... 72 4.2.3. Textura del suelo ........................................................................................................ 75 4.2.4. Nutrientes del suelo N, P2O5, K2O ............................................................................. 75 4.3. Evaluar la eficiencia de la biorremediación del suelo contaminado con Pb empleando H. annuus y humus de E. foetida de los tratamientos en estudio ............................... 76 4.4. Determinar el porcentaje de reducción de Pb que tiene el suelo del tratamiento con mayor efectividad de biorremediación ....................................................................... 79 CAPÍTULO V: CONCLUSIONES ..................................................................................... 80 CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES .......................................................................... 82 REFERENCIAS .................................................................................................................. 83 TERMINOLOGÍA .............................................................................................................. 93 APÉNDICES ....................................................................................................................... 95 11 ÍNDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1. Tipos de biorremediación ...................................................................................... 30 Tabla 2. Clasificación taxonómica ...................................................................................... 33 Tabla 3. Clasificación taxonómica ...................................................................................... 35 Tabla 4. Descripción de los puntos de muestreo según coordenadas ................................. 44 Tabla 5. Factores de la investigación .................................................................................. 46 Tabla 6. Tratamientos de la investigación. .......................................................................... 48 Tabla 7. Codificación de los tratamientos de la investigación con sus repeticiones .......... 48 Tabla 8. Variables de la investigación ................................................................................ 49 Tabla 9. Materiales y equipos utilizados en la investigación .............................................. 53 Tabla 10. Análisis de las propiedades del suelo antes de los tratamientos ........................ 54 Tabla 11. Propiedades fisicoquímicas del H. annuus ......................................................... 55 Tabla 12. Concentración de plomo final en las plantas ....................................................... 55 Tabla 13. Capacidad de intercambio catiónico (CIC) ........................................................ 56 Tabla 14. Potencial de Hidrógeno (pH) .............................................................................. 56 Tabla 15. Conductividad eléctrica (CE) .............................................................................. 57 Tabla 16. Textura del suelo ................................................................................................. 57 Tabla 17. Nutrientes del suelo N, P2O5, K2O ...................................................................... 58 Tabla 18. Análisis de varianza para la presencia de Pb en suelo ....................................... 59 Tabla 19. Valores promedio de presencia de Pb en el suelo ............................................... 60 Tabla 20. Prueba Tukey (95 %) para la presencia de plomo en suelo ................................ 60 Tabla 21. Análisis de Varianza para la presencia de Pb en tallos de H. annuus ............... 61 Tabla 22. Valores promedio de presencia Pb en los tallos de H. annuus ........................... 62 Tabla 23. Análisis de Varianza para la presencia de Pb en hojas de H. annuus ............... 63 Tabla 24. Valores promedio de presencia de Pb en las hojas de H. annuus (mg·kg⁻¹) ....... 64 Tabla 25. Comparación de prueba Tukey (95 %) para la presencia de Pb en las hojas de H. annuus ....................................................................................................... 65 Tabla 26. Análisis de Varianza para la presencia de Pb en raíces de H. annuus............... 66 Tabla 27. Valores promedio de presencia de Pb en las raíces de H. annuus ..................... 67 Tabla 28. Prueba Tukey (95 %) para la presencia de Pb en las raíces de H. annuus ........ 67 Tabla 29. Valores promedio de presencia de Pb en los tratamientos del suelo .................. 69 12 ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1. Mapa de ubicación del área donde se ejecutó el experimento ............................ 39 Figura 2. Mapa de ubicación de los puntos de muestreo .................................................... 39 Figura 3. Diagrama de operaciones .................................................................................... 42 Figura 4. Localización de puntos de muestro del terreno del suelo contaminado .............. 43 Figura 5. Análisis de Varianza para la presencia de plomo (Pb) ....................................... 59 Figura 6. Gráfica de la Prueba Tukey (95 %) para la presencia de plomo en suelo .......... 61 Figura 7. Análisis de Varianza para la presencia de Pb en tallos de H. annuus ................ 62 Figura 8. Análisis de Varianza para la presencia de Pb en hojas de H. annuus ................ 63 Figura 9. Gráfica de la Prueba Tukey (95 %) para la presencia de Pb en las hojas de H. annuus .......................................................................................................... 65 Figura 10. Análisis de Varianza para la presencia de Pb en raíces de H. annuus ............. 66 Figura 11. Gráfica de la Prueba Tukey (95 %) para la presencia de Pb en las raíces de H. annuus ............................................................................................................ 68 13 ÍNDICE DE APÉNDICES Pág. Apéndice 1. Perforación de calicata y toma de muestras ................................................... 95 Apéndice 2. Homogenización y tamizado de muestras recolectadas ................................. 96 Apéndice 3. Pesaje de las muestras de suelos .................................................................... 96 Apéndice 4. Siembra de semillas ........................................................................................ 97 Apéndice 5. Crecimiento del H. Annuus. L. (Girasol) ....................................................... 98 Apéndice 6. Resultados de los análisis de la muestra de suelo y humus antes de la investigación ................................................................................................... 99 Apéndice 7. Resultados de los análisis de los tratamientos después de la investigación . 100 Apéndice 8. Resultados de los análisis de las partes morfológicas del H. Annuus .......... 101 Apéndice 9. Resultados de análisis de características fisicoquímicas del suelo .............. 104 Apéndice 10. Características morfológicas del H. Annuus .............................................. 105 Apéndice 11. Resultados del análisis de Pb final en los tratamientos .............................. 108 14 RESUMEN El presente estudio tuvo como objetivo determinar la eficiencia del H. annuus en simbiosis con humus de E. foetida para la biorremediación de suelos contaminados con plomo (Pb) en la región de Piura. Se desarrolló un experimento bajo un diseño de bloques completamente al azar, empleando nueve tratamientos con tres repeticiones cada uno. Las unidades experimentales consistieron en bolsas almacigueras con 1 kg de suelo contaminado, al que se incorporaron proporciones de humus (25 %, 50 %, 75 %) y diferentes cantidades de semillas (3, 5 y 7). El suelo presentaba una concentración inicial de Pb de 268,421 mg·kg⁻¹, un pH ácido (5,01) y baja conductividad eléctrica (283 µS/cm), condiciones desfavorables para la actividad biológica. Los análisis evidenciaron que el tratamiento T1 logró una remoción del 69,76 %, con una concentración final de 81,178 mg·kg⁻¹. Además, los tratamientos T2 y T3 presentaron mejores características morfológicas del girasol y mejoras en las propiedades fisicoquímicas del suelo. Se observó acumulación de Pb principalmente en las raíces. La interacción entre el número de semillas y el porcentaje de humus tuvo efectos estadísticamente significativos en la eficiencia de biorremediación. En conclusión, la combinación de H. annuus y humus de E. foetida representa una estrategia efectiva para la biorremediación de suelos contaminados con plomo. Palabras clave: biorremediación, enmiendas húmicas, fitorremediación, Helianthus annuus L. 15 ABSTRACT The objective of this study was to determine the efficiency of H. annuus in symbiosis with E. foetida humus for the bioremediation of lead (Pb) contaminated soils in the Piura region. An experiment was developed under a completely randomized block design, using nine treatments with three replicates each. The experimental units consisted of almacigueras bags with 1 kg of contaminated soil, to which humus proportions (25 %, 50 %, 75 %) and different amounts of seeds (3, 5 and 7) were incorporated. The soil had an initial Pb concentration of 268,421 mg·kg⁻¹, an acid pH (5,01) and low electrical conductivity (283 µS/cm), unfavorable conditions for biological activity. The analyses showed that treatment T1 achieved a removal of 69,76 %, with a final concentration of 81,178 mg·kg⁻¹. In addition, treatments T2 and T3 presented better morphological characteristics of the sunflower and improvements in the physicochemical properties of the soil. Pb accumulation was observed mainly in the roots. The interaction between seed number and humus percentage had statistically significant effects on bioremediation efficiency. In conclusion, the combination of H. annuus and E. foetida humus represents an effective strategy for the bioremediation of lead-contaminated soils. Keywords: bioremediation, humic amendments, phytoremediation, Helianthus annuus L. 16 INTRODUCCIÓN La contaminación de suelos por metales pesados representa uno de los principales desafíos ambientales a nivel global, afectando tanto la calidad de los ecosistemas y la salud de las personas. Este problema se ha intensificado por las actividades industriales como la minería, metalurgia, la agricultura intensiva y la contaminación vehicular (Neira et al., 2021). En América Latina, Perú presentan altos niveles de contaminación, principalmente por actividades mineras, industriales, agrícolas, entre otras (Cerrón, 2022). En la región de Piura, zonas como Canchaque presentan suelos contaminados debido a residuos mineros generados por la mina Turmalina. Esta ex unidad minera ha desencadenado una serie de daños al medio ambiente, generando pasivos ambientales por relaves cargados de metales como plomo, cadmio y cobre, lo que ha afectado tanto a la producción agrícola como a la salud de la comunidad (Zapata, 2019). El plomo (Pb) es considerado uno de los contaminantes más peligrosos debido a su alta toxicidad, capacidad de bioacumulación y persistencia en el ambiente (Munive et al., 2020). Su presencia en el suelo puede alterar el microbiota, disminuir la fertilidad y afectar a las cadenas tróficas (Moslehi et al., 2019). Ante esta problemática, la biorremediación surge como una estrategia sostenible para la recuperación de suelos degradados. Según Picoy (2016), la biorremediación utiliza organismos vivos para transformar o eliminar contaminantes de manera eficiente y respetuosa con el medio ambiente. Dentro de las técnicas de biorremediación, la fitorremediación, que emplea plantas capaces de absorber y acumular metales pesados, ha demostrado ser una alternativa altamente eficaz (Julca, 2022). Entre las especies utilizadas destaca H. annuus, reconocida por su elevada capacidad de acumulación de Pb en sus tejidos (Vital, 2019). La eficacia de este proceso puede potenciarse mediante el uso de enmiendas orgánicas como el humus de E. foetida (lombriz roja), que mejora la estructura del suelo, incrementa la disponibilidad de nutrientes y facilita la movilidad de los metales pesados hacia las plantas (Ataucasi y Bellido, 2022). 17 Estudios recientes han demostrado que la combinación de plantas hiperacumuladoras y enmiendas orgánicas puede incrementar significativamente la eficiencia de la fitorremediación (Marcellini, 2025). En este contexto, el uso conjunto de H. annuus y humus de E. foetida representa una estrategia innovadora para restaurar suelos contaminados por plomo, optimizando tanto la absorción de metales como la recuperación de la fertilidad del suelo. La importancia de este estudio radica en ofrecer una solución sostenible como es la biorremediación utilizando H. annuus en simbiosis con humus de E. foetida aplicado a suelos contaminados por metales pesados en la región de Piura, contribuyendo tanto a la recuperación ambiental y la seguridad alimentaria local. Además, esta investigación aporta información nueva para la región, donde no se habían evaluado combinaciones específicas de H. annuus y humus de E. foetida en procesos de biorremediación de suelos afectados por Pb. Asimismo, los resultados obtenidos podrán ser la base para futuras investigaciones y el desarrollo de tecnologías de remediación adaptadas a condiciones locales. El objetivo general de este trabajo fue determinar la capacidad de biorremediación del H. annuus en simbiosis con humus de E. foetida en suelos contaminados con Pb. Para alcanzar este propósito, se plantearon como objetivos específicos: caracterizar las propiedades del suelo como pH, temperatura, conductividad eléctrica y humedad, así como la concentración inicial de plomo; estudiar algunas propiedades fisicoquímicas del H. annuus, incluyendo altura de la planta, crecimiento de raíz, cantidad de hojas y concentración final de Pb; evaluar la eficiencia de la biorremediación del suelo contaminado mediante el empleo conjunto de H. annuus y humus de E. foetida; y finalmente, determinar el porcentaje de reducción de Pb en el tratamiento que presentó mayor efectividad de remediación. La tesis se organizó en seis capítulos. El Capítulo I: Marco Teórico comprendió los antecedentes nacionales e internacionales, así como los conceptos fundamentales relacionados con la biorremediación, la fitorremediación, las características del Helianthus annuus y las propiedades del humus de E. foetida. En el Capítulo II: Materiales y Métodos, se describieron detalladamente los materiales utilizados y el diseño experimental bifactorial 18 aplicado, especificando los procedimientos de muestreo, análisis de laboratorio y métodos estadísticos empleados. El Capítulo III: Resultados presentó los principales hallazgos obtenidos, incluyendo la evolución de las propiedades fisicoquímicas del suelo y las características morfológicas del H. annuus en los diferentes tratamientos. Posteriormente, en el Capítulo IV: Discusión, se contrastaron los resultados obtenidos con los reportados por otros autores, resaltando la efectividad de la estrategia aplicada y la influencia de variables del suelo en el proceso de remediación. En el Capítulo V: Conclusiones, se sintetizaron los principales hallazgos en función de los objetivos planteados, y finalmente, en el Capítulo VI: Recomendaciones, se propusieron acciones futuras y posibles líneas de investigación basadas en los resultados del estudio. 19 OBJETIVOS Objetivo General Determinar la capacidad de biorremediación del H. annuus en simbiosis con humus de E. foetida en suelos contaminados con Pb. Objetivos Específicos • Caracterizar las propiedades del suelo (pH, temperatura, conductividad eléctrica y humedad), y la concentración de plomo inicial. • Estudiar algunas de las propiedades fisicoquímicas de H. annuus (altura de la planta, crecimiento de raíz, cantidad de hojas y concentración final de Pb) y sustrato experimental (NPK, textura, capacidad de intercambio catiónico, conductividad eléctrica y pH) de los tratamientos. • Evaluar la eficiencia de la biorremediación del suelo contaminado con Pb empleando H. annuus y humus de E. foetida de los tratamientos en estudio. • Determinar el porcentaje de reducción de Pb que tiene el suelo del tratamiento con mayor efectividad de biorremediación. 20 CAPÍTULO I: MARCO TEÓRICO 1.1. Antecedentes Internacionales Valdiviezo et al. (2024) realizaron una investigación en el “Uso de la planta de girasol (H. annuus L.), con adiciones de ácido húmico y zinc en la fitorremediación de suelos cacaoteros con cadmio” en la provincia del Guayas Pedro Carbo, Guayas, Ecuador. Tuvieron como objetivo evaluar la acumulación de cadmio en la planta de girasol. La investigación fue de tipo experimental, aplicando un diseño de bloques completamente al azar (DBCA). La población experimental consistió en suelos cacaoteros contaminados con una concentración inicial de 0,50 mg·kg⁻¹ de cadmio y 0,69 mg·kg⁻¹. Utilizaron cuatro tratamientos con cuatro repeticiones; T1: suelo; T2: suelo + ácido húmico; T3: suelo + ácido húmico + sulfato de zinc; T4: suelo + sulfato de zinc. Las unidades experimentales estuvieron representadas por una bolsa de 18 kg sembrada con una semilla de girasol. El análisis estadístico fue efectuado mediante un análisis de varianza (ANOVA), complementado con la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y la comparación de medias a través del test de Duncan (p < 0,05), empleando el software Statistical Analysis System (SAS), versión 7.0. Los resultados mostraron que los tratamientos tuvieron efecto en las concentraciones de cadmio en el suelo disminuyendo su cantidad inicial de 0,50 mg·kg⁻¹ a un T1: 0,28 mg·kg⁻¹; T2: 0,15 mg·kg⁻¹, T3: 0,11 mg·kg⁻¹ y T4: 0,10 mg·kg⁻¹. Sin embargo, las concentraciones de zinc aumentaron su valor inicial a 158 mg·kg⁻¹ en el T3. Concluyó que el girasol puede actuar por si sola como una planta fitoestabilizadora eficaz en suelos contaminados con cadmio, y que no requiere la adición de sustancias impulsoras como el ácido húmico y zinc. Velarde et al. (2024) realizaron la investigación titulada “Eficiencia entre H. annuus y Z. mays en la remoción de plomo en suelos contaminados”, desarrollada en el distrito de Huamachuco, región La Libertad, Perú. El objetivo principal fue comparar la eficiencia de remoción de Pb entre dos especies vegetales: H. annuus y Z. mays en suelos contaminados por relaves mineros. El estudio fue de tipo experimental, con un diseño transversal y enfoque cuantitativo. La muestra consistió en 15 kg de suelo contaminado, recolectado de zonas 21 cercanas a los relaves mineros del Cerro El Toro, donde se reportaron concentraciones de hasta 401 mg·kg⁻¹ de Pb, superando el estándar ambiental (ECA Suelo: 70 mg·kg⁻¹). Utilizaron como instrumento de recolección una ficha de datos y como técnica la observación experimental. Los datos fueron procesados con Microsoft Excel y SPSS versión 22, aplicando análisis de normalidad (Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov) y la prueba T- Student para muestras relacionadas. Los resultados demostraron que Zea mays L. obtuvo una eficiencia de remoción de Pb del 62,85 %, reduciendo la concentración de 401 mg·kg⁻¹ a 148,97 mg·kg⁻¹. Por su parte, Helianthus annuus logró una remoción del 53,57 %, con una reducción de 401 mg·kg⁻¹ a 186,20 mg·kg⁻¹. La prueba estadística reportó un valor de significancia bilateral de 0,003, lo cual indica que existe diferencia significativa entre ambas especies, siendo el maíz más eficiente. Los autores concluyeron que Z. mays es la especie vegetal más eficiente en la reducción de la concentración de plomo en suelos contaminados, y que su uso representa una alternativa ambientalmente viable para la recuperación de áreas afectadas por actividades mineras informales en la sierra norte del Perú. García et al. (2021), en su investigación, “Evaluación de la adaptación de H. annuus en asociación con hongos micorrizicos en suelos contaminados con plomo en Medellín, Colombia”, tuvieron como objetivo evaluar la adaptación del H. annuus en asociación con hongos micorrízicos en la biorremediación de suelos contaminados por plomo. La investigación fue de tipo experimental, bajo un diseño completamente al azar (DCA) de 4 x 2, conformado por ocho tratamientos con tres repeticiones. La población experimental incluyó plantas de H. annuus cultivadas en macetas de 16,5 cm de ancho, 25 cm de alto y 49 cm de largo, con suelos tratados con concentraciones de plomo de 0, 300, 500 y 700 mg·kg⁻¹, tanto con inoculación micorrízica como sin ella. Para la recolección de datos, utilizaron mediciones periódicas de longitud del tallo, alteraciones morfológicas, peso fresco y peso seco, realizadas tres veces por semana durante un periodo de 30 días. El análisis estadístico fue llevado a cabo en el programa Statgraphics Centurión XVII, mediante análisis de varianza (prueba F) y prueba de comparación de medias de Duncan al 5 % de significancia. Los resultados indicaron que el tratamiento T2 (300 mg·kg⁻¹ de Pb sin micorrizas) presentó la menor producción foliar, mientras que el tratamiento T1, con micorrizas, reflejó el mayor crecimiento del tallo. El estudio concluyó que tanto el H. annuus como los hongos micorrízicos lograron adaptarse a diferentes concentraciones de plomo en el suelo, contribuyendo así al proceso de biorremediación. 22 Martínez y Marrugo (2021) llevaron a cabo una investigación titulada, “Efecto de la adición de enmiendas en la inmovilización de metales pesados en suelos mineros del sur de Bolívar, Colombia”. En ella tuvieron como objetivo evaluar la inmovilización de metales pesados (mercurio, plomo, cadmio y arsénico) en suelos contaminados por actividades mineras, mediante la aplicación de enmiendas orgánicas e inorgánicas. La investigación fue de tipo experimental y aplicó un diseño de bloques completamente al azar (DBCA), considerando dos factores: tipo de enmienda (biochar, vermicompost y cal) y dosis (tres niveles por enmienda), incluyendo un tratamiento control y tres repeticiones por tratamiento. Las dosis aplicadas fueron: biochar (D1=0,5 %, D2=2 %, D3=4 %), vermicompost (L1=5 %, L2=10 %, L3=15 %) y cal (C1=0,5 %, C2=1 %, C3=2 %). El análisis estadístico fue efectuado mediante análisis de varianza (ANOVA), utilizando el software Statgraphics Plus, versión 5,0. Los resultados indicaron que las enmiendas de vermicompost y cal lograron mayor efectividad en la retención de plomo, cadmio y mercurio en un 50 %. Asimismo, las tres enmiendas contribuyeron positivamente a la reducción de la biodisponibilidad de metales pesados, logrando de esta manera un porcentaje de biodisponibilidad menor a un 2,1 %. El estudio concluyó que las enmiendas húmicas aplicadas fueron efectivas en la inmovilización de metales pesados, representando una alternativa viable para la biorremediación de suelos contaminados por actividades mineras. Sarmiento y Febres (2021) desarrollaron una investigación titulada “Recuperación de plomo en suelo agrícola contaminado artificialmente como estrategia de remediación mediante girasol y vermicompost” en el invernadero de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa, Perú. El estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del H. annuus y el vermicompost en la remediación de suelos agrícolas contaminados artificialmente con Pb. La investigación fue de tipo experimental, con un diseño completamente al azar, conformado por cuatro tratamientos con tres repeticiones cada uno, totalizando doce unidades experimentales. Los tratamientos fueron: T1 (suelo con Pb, vermicompost y girasol), T2 (suelo con Pb y vermicompost), T3 (suelo con Pb y H. annuus) y T4 (solo suelo con Pb). Utilizaron una concentración inicial de 121,05 ppm de Pb, superando el Estándar de Calidad Ambiental (ECA) para suelos agrícolas en Perú, que es de 70 ppm. Cada tratamiento fue establecido en macetas con 5 kg de suelo contaminado y se incorporaron 0,25 kg de vermicompost en los tratamientos que lo requerían. El análisis estadístico lo realizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) y prueba de comparación 23 de medias de Tukey con un nivel de significancia de p ≤ 0,05, utilizando el software SPSS v22. Los resultados mostraron que todos los tratamientos redujeron la concentración de Pb por debajo del ECA, siendo el tratamiento T2 el más eficiente, con una recuperación de Pb del 81,21 %. En el análisis del comportamiento del H. annuus, evidenciaron que en presencia de vermicompost (T1) la planta actuó como fitoestabilizadora (Factor de Translocación < 1), mientras que en ausencia del vermicompost (T3), funcionó como fitoextractora (FT > 1). Además, el vermicompost incrementó la materia orgánica y la capacidad de intercambio catiónico (CIC) del suelo, mejorando su calidad. Concluyeron que el uso combinado de H. annuus y vermicompost constituye una estrategia viable y eficiente para la remediación de suelos agrícolas contaminados con Pb, y puede ser aplicado como alternativa ecológica en escenarios con riesgo ambiental. Jiménez (2020) llevó a cabo una investigación en “Análisis descriptivo del H. annuus y z. mays como acumuladores de (Cd, Pb) para la recuperación de suelos agrícolas contaminados”, Ecuador. Tuvo como objetivo principal analizar la capacidad de acumulación de Cd y Pb en H. annuus y Z. mays. La investigación siguió una metodología no experimental, donde realizó la revisión de trabajos de investigación respecto a la eficiencia de estas especies. Para la recopilación de datos utilizaron el método de comparación. El tratamiento de la información fue efectuado mediante estadística descriptiva, tablas y gráficos. Los resultados indicaron que el H. annuus presentó una alta eficiencia en la remoción de Pb en un 53,57 %, mientras que la especie Z. mays fue más eficiente en la remoción de Pb con un 62,5 %. Concluyó que tanto el H. annuus y el Z. mays son unas excelentes especies Fitoextractoras con gran porcentaje de traslocación del metal pesado. Nacionales Canchan et al. (2023) realizaron una investigación en “El vermicompost, una alternativa en la recuperación de suelos contaminados con metales pesados en la Mina Yauricocha 2023” realizado en los suelos contaminados de la mina Yauricocha, Huancayo, Perú. Tuvieron como objetivo recabar información que explicara el potencial del vermicompost para recuperar suelos contaminados. Realizaron búsquedas exhaustivas de investigaciones que fundamentaran la remoción de metales en suelos contaminados por plomo (Pb), zinc (Zn) y 24 cobre (Cu), utilizando palabras claves como; vermicompost, metales pesados y biopilas. Posterior a ello filtraron aquella información más relevante para el estudio. Los resultados muestran la eficiencia del vermicompost para remover Pb (93 %), Cu (86,7 %) y Zn (88 %). Además, los estudios bibliográficos calificaron que mediante la técnica de biopilas la biorremediación de metales pesados asciende a un 95 %. Concluyeron que la alternativa (humus de lombriz) contribuye significativamente a la remediación de suelos afectados por metales pesados. Cerrón (2022) realizó una investigación en “Reducción de plomo en suelos contaminados por relaves metalúrgicos en la planta UNCP-Yauris mediante fitoextracción con girasol y enmienda de vermicompost”. En ella evaluó el potencial biorremediador del H. annuus para reducir el nivel de Pb en suelos afectados por desechos metalúrgicos por espectrofotometría en Huancayo. La metodología fue experimental con una muestra de 15 kg de suelo contaminados con plomo. Estableció tres tratamientos y un testigo, además, realizó cuatro repeticiones, donde agregó un 25, 50, 75 % de vermicompost en cada tratamiento, sin considerar el testigo. Por otra parte, colocó 2 semillas por tratamiento utilizando en total 15 kg de suelo contaminado y 30 semillas. Una vez recolectado los datos, estos fueron analizados a través del diseño completo al azar (DCA) con un solo factor, en el programa SPSS. Los resultados mostraron que el tratamiento T2 (suelo contaminado + 50 % vermicompost) tuvo una mayor absorción con una cantidad de 216,39 mg·kg⁻¹. Concluyó que, emplear humus de lombriz ayuda a extraer y remover el Pb en suelos contaminados. Julca (2022) llevó a cabo una investigación en “Capacidad fitorremediadora del maíz y el girasol en suelos contaminados del botadero municipal de Lucma” en la ciudad de Trujillo. Evaluó la capacidad fitorremediadora del Zea mays L., y del H. annuus en suelos contaminados con metales pesados, como plomo (Pb), mercurio (Hg), cadmio (Cd) y arsénico (As). La metodología empleada fue experimental en la cual aplicaron tres tratamientos de semillas de H. annuus y Z. mays. La investigación tuvo un enfoque cuantitativo y alcance descriptivo donde recolectaron seis muestras mediante un muestreo aleatorio estratificado del botadero; para cada muestra, excavaron una calicata con dimensiones de: 1x1x1,5 m de ancho, largo y profundidad respectivamente. De ella extrajeron aproximadamente 2 kg de suelo por punto de muestreo. Posteriormente, las 25 muestras fueron evaluadas en laboratorio y cuyos resultados fueron analizados estadísticamente para determinar la existencia de una remoción significativa de metales pesados. Los resultados obtenidos evidenciaron que las especies estudiadas lograron una absorción de plomo del suelo equivalente a 41,51 %; 43,47 % y 44,44 %, respectivamente. En conclusión, los resultados demostraron que el H. annuus y Z. mays son agentes fitorremediadores altamente efectivos, capaces de contribuir significativamente a mitigar suelo contaminados por metales pesados. Ramírez y Saurin (2022) evaluaron la absorción de Pb por H. annuus en suelo contaminado, a través de un agente remediador de quelante. Para ello, emplearon una metodología experimental, con una muestra de 90 kg de tierra mediante el método de zig- zag, los cuales fueron repartidos en cada masetero (10, 20 mg·kg⁻¹ de plomo). Establecieron seis tratamientos (Niveles de Pb [mg·kg⁻¹] y quelante [mmol·kg⁻¹] en las muestras contaminadas) con tres repeticiones. Para el análisis de los datos aplicaron un ANOVA a un 95 % de significancia, obteniendo como resultados que el T3 fue el óptimo para remediar suelos contaminados, con un promedio de plomo de 26,19 ppm, siendo el T6 el menos optimo con un promedio de 2,01 ppm. Concluyeron que, los tratamientos no muestran mayor significancia al usar quelante en las diferentes relaciones establecidas (0 y 2,5 mmol·kg⁻¹). Vargas (2021) realizó una investigación en “Efecto de tres extractos húmicos en la remoción del zinc (Zn), cobre (Cu), plomo (Pb) y cadmio (Cd) en suelos franco-arenosos contaminados, Huaraz, Perú 2016”. Tuvo como objetivo determinar la eficiencia de remoción de los extractos húmicos sobre los metales pesados. La metodología empleada fue experimental, desarrollado bajo un diseño de bloques completamente aleatorizado, con tres tratamientos experimentales de similar concentración: T1: Extracto húmico al 5 %; T2: Extracto húmico de lombricompost al 5 % y T3: Extracto húmico de MO. de bosque de quebrada al 5 %. Dos tratamientos testigos: T1: 100 % sustrato agrícola y T2: Sustrato experimental con 0 % extractos. Cada tratamiento contó con tres repeticiones, así como con cuatro semillas de cebada variedad UNA Centenario, sumando15 unidades experimentales. El enfoque del estudio fue cuantitativo. La metodología consistió en utilizar tres extractos húmicos: humus formulado, lombricompost y materia orgánica de bosque de quebrada. En conjunto con plantas de cebada para remediar suelo contaminado por metales pesados (Zn, 26 Cu, Pb y Cd) provenientes de relaves mineros. Midió la eficiencia en las características morfológicas de la planta, así como el porcentaje inicial y final de metales en el suelo. Los resultados evidenciaron que el tratamiento T2 presentó mayor eficiencia (65 %) de remoción de metales pesados como Zn, Cu, Pb y Cd prestando menor índice de toxicidad (104,28) y un factor de bioacumulación (2,850) de inferior a los demás. Concluyó que los extractos húmicos influyeron significativamente en la remoción de metales, sin embargo, los resultados obtenidos no cumplieron las expectativas de la investigación. 1.2. Bases teóricas especializadas 1.2.1. Contaminación del suelo El recuso suelo se ve afectado entre otros agentes contaminantes por la presencia de metales pesados, que pueden generar graves implicaciones en el bienestar de los ecosistemas y biodiversidad, como en la salud de los seres humanos. Los metales pesados son elementos químicos que se distinguen por tener una densidad relativamente alta mayor a 4 g·𝑐𝑚−3y representa riesgo latente para los ecosistemas (Falcon, 2017). Los metales pesados más comunes que pueden contaminar el suelo son: Plomo, mercurio, cadmio, arsénico, cromo y níquel. Estos metales se liberan en el suelo a través de diversas fuentes, como la industria, la agricultura, la minería, y los desechos urbanos, entre otros (Munive, 2018). Según Garzón et al. (2017) las principales fuentes de la contaminación del suelo por metales pesados son: • Industria. Las actividades industriales liberan metales pesados directa o indirectamente al suelo, como resultado de un proceso de producción mediante vertimiento directo de los residuos o emisión atmosférica. • Agricultura. La aplicación excesiva de fertilizantes y pesticidas que contienen metales pesados, así como la aplicación de lodos depuradora en campos agrícolas, puede ser una fuente importante de contaminación del suelo. • Minería. Las operaciones mineras pueden liberar metales pesados que entrar en contacto directo con el suelo y lo impactan negativamente a través de desechos de minería y escombros. 27 • Desechos urbanos. La disposición inadecuada de desechos sólidos urbanos y la incineración de residuos pueden liberar metales pesados en el suelo. Contaminación del suelo por elementos pesados La contaminación del suelo por metales pesados es uno de los principales problemas ambientales que ocurren a nivel nacional y mundial, debido a varios factores, como es el crecimiento demográfico, es decir, existe una demanda mucho mayor de alimentos y su producción (Garzón et al., 2017). El Pb, Cd, Cr, Hg, Zn, Cu, Ag y As son metales pesados, que fungen un rol importante en la función celular, sin embargo, su presencia en cantidades elevadas representa un agente toxico para la salud de los seres vivos (Londoño et al., 2016). Las concentraciones de metales pesados en diversos ecosistemas y organismos son casi nulas (mg·kg⁻¹). Sin embargo, una alteración en el suelo puede generar degradación severa conocida como contaminación, y esto sucede cuando hay concentraciones anormales presentes en el suelo, las cuales se pueden originar de forma geogénica o antropogénica (Jano, 2017). Las concentraciones anormales en el suelo de origen geogénico son causadas por elementos derivados de la roca madre, actividad volcánica o lixiviación de mineralizaciones. Mientras que concentraciones anormales de metales en el suelo de origen antropogénicos provienen principalmente de desechos peligrosos urbanos y mineros, así como de desechos industriales y agrícolas. Legalmente, la sustancia producida por estos contaminantes se considera contaminación (Jano, 2017). Contaminación de suelos por plomo Según Sánchez (2022), el impacto del plomo (Pb) en el suelo se posiciona como uno de los problemas medioambientales más significativos para la población y autoridades. Esto ocasiona que temas como la caracterización, evaluación y remediación del suelo afectados por metales pesados sean motivo de análisis constante, debido al significativo aumento de su concentración y por su biodisponibilidad en el ambiente (Sánchez, 2022). 28 El plomo es un metal pesado que ha sido liberado al medio ambiente al transcurrir el tiempo debido tanto actividades naturales, como erupciones volcánicas y antropogénicas como la minería o la combustión de gasolina con contenido de Pb (Jano, 2017). Este metal tiene la particularidad de ser altamente tóxico para los seres humanos, flora y fauna de los ecosistemas. Su distribución y su acumulación química en el suelo depende del pH, mineralogía, textura, materia orgánica y la naturaleza de los compuestos de plomo contaminantes (Pajoy, 2017). Diversas normativas internacionales y nacionales han establecido límites para la concentración de Pb en suelos agrícolas con el fin de prevenir riesgos asociados. Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, 2019) los límites para suelos residenciales y áreas de juegos infantiles son superiores a 400 mg·kg⁻¹, sin embargo, para suelos agrícolas, los valores permitidos suelen ser más estrictos. En países como Canadá, se ha fijado un límite de 70 mg·kg⁻¹, para suelos agrícolas, reconociendo la necesidad de proteger los cultivos y la salud de los consumidores (Díaz et al., 2023). Según el Ministerio del Ambiente (MINAN, 2017) en el Perú, los Estándares de Calidad Ambiental (ECA) para suelos establecen que la concentración máxima permisible de plomo (Pb) en suelos destinados a la agricultura es de 70 mg·kg⁻¹. Estos valores reflejan la necesidad de preservar la salud pública y la calidad de los cultivos. Comportamiento químico del plomo en el suelo El comportamiento del plomo (Pb) en el suelo está determinado por su alta afinidad con los coloides y componentes minerales presentes en la matriz edáfica. Una vez depositado, el plomo no se moviliza fácilmente a través del perfil del suelo, sino que tiende a adsorberse fuertemente en la fracción sólida, especialmente en arcillas, óxidos de hierro, aluminio y materia orgánica. Esta fuerte adsorción se debe a la formación de complejos estables, lo cual reduce su movilidad, pero no necesariamente su disponibilidad biológica (Sánchez, 2022). El pH del suelo influye significativamente en su solubilidad: en suelos ácidos (pH < 6,5), el plomo puede encontrarse en formas más solubles como Pb²⁺, lo que incrementa su biodisponibilidad y su riesgo de absorción por las plantas o lixiviación hacia aguas 29 subterráneas (Sánchez, 2022). En cambio, en suelos con pH neutro o ligeramente alcalino, el plomo tiende a precipitarse formando compuestos poco solubles como carbonatos o fosfatos de plomo. La materia orgánica también juega un papel dual en la dinámica del plomo: por un lado, puede inmovilizarlo mediante la formación de complejos orgánicos estables; y por otro, puede movilizarlo si se encuentra en formas solubles (ácidos húmicos y fúlvicos) que forman quelatos con el metal. De igual forma, la textura del suelo afecta su retención: suelos finos, ricos en arcilla, poseen mayor capacidad de retención de Pb que suelos arenosos, donde predomina la lixiviación (Sánchez, 2022). Asimismo, factores como la capacidad de intercambio catiónico (CIC), la concentración de otros cationes competidores (Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺), la humedad y la temperatura también influyen en el comportamiento del plomo. En condiciones anaeróbicas o con cambios en la redox del suelo, el Pb puede formar compuestos insolubles como PbS (sulfuro de plomo), reduciendo su movilidad (Jano, 2017). Por lo tanto, aunque el plomo tiende a ser inmovilizado en la fracción sólida del suelo, su toxicidad y biodisponibilidad dependen de factores fisicoquímicos que pueden variar significativamente según las condiciones edáficas. Esta compleja interacción condiciona las estrategias de biorremediación, como el uso de plantas fitoestabilizadoras o acumuladoras (Pajoy, 2017). 1.2.2. Biorremediación La biorremediación es un proceso que emplea organismos vivos, como bacterias, hongos, plantas o enzimas, para degradar contaminantes, eliminarlos o transformarlos en elementos menos tóxicos, minimizando su impacto y peligrosidad (Sihuacollo, 2015). Esta técnica se utiliza principalmente para remediar la contaminación del suelo, agua y aire. La biorremediación aprovecha la capacidad natural de ciertos microorganismos para 30 metabolizar o degradar compuestos tóxicos, convirtiéndolos en productos no tóxicos o menos dañinos (Picoy, 2016). Tipos de biorremediación Según el tipo de contaminante y el medio afectado, existen tres tipos de biorremediación las cuales se describen a continuación: Degradación microbiana. Implica el uso de bacterias, hongos u otros microorganismos que mediante diferentes procesos metabólicos naturales descomponen y transforman los contaminantes reduciendo su toxicidad (Montenegro et al., 2020). Degradación enzimática. Requiere el uso de enzimas obtenidas de microorganismo especiales para la degradación sustancias toxicas (Fabelo, 2016) Fitorremediación. Utiliza plantas para absorber y acumular contaminantes en sus tejidos, lo que a menudo se combina con la biorremediación microbiana (Simabaña, 2016). Dentro, de la Biorremediación microbiana existen dos tipos de biorremediación fundamentales para la remoción de metales pesados, tal y como se describe en la Tabla 1 (Sánchez, 2022). Tabla 1 Tipos de biorremediación Tipos de biorremediación Descripción Bioprecipitación Uso de microrganismos capaces de generar metabolitos con el fin de precipitar los metales pesados., entre ellos tenemos las bacterias sulfato reductoras. Bioaumentación Técnica que se usa en laboratorio con la diferencia que es en ambientes de suelo o agua. Nota. Elaboración propia a partir de Sánchez (2022). Biología molecular y su aporte a la biorremediación de sitios contaminados por hidrocarburos en el noroeste del Perú. http://repositorio.unp.edu.pe/handle/20.500.12676/3675 31 Ventajas de la biorremediación La biorremediación presenta diversas ventajas, entre las cuales destaca su carácter ecoamigable y sostenible, lo que la convierte en una alternativa favorable frente a otros métodos de remediación ambiental. Además, suele resultar más económica, especialmente cuando se aplica in situ, ya que reduce la necesidad de excavar y transportar materiales contaminados. Otra ventaja importante es su capacidad para integrarse con otras técnicas de remediación, potenciando así la eficacia del proceso en su conjunto (Sánchez, 2022). Limitaciones de la biorremediación Según Oviedo (2022) la efectividad de la biorremediación puede verse afectada por algunos factores como: Disponibilidad de nutrientes. necesario para un correcto crecimiento y adecuado metabolismo de las bacterias, si existe deficiencia de este la existencia de las bacterias degradadoras se vería afectado. Temperatura. Está estrechamente relacionado el bienestar de los microorganismos degradadores, influye en el comportamiento de los contaminantes en gran medida la temperatura es responsable del éxito de la biorremediación. pH. Influye en el crecimiento de los microorganismos encargados de la degradación en el proceso de biorremediación. 1.2.3. Fitorremediación La técnica de fitorremediación consiste en emplear diversas especies vegetales con la capacidad de absorber, acumular o transformar metales, contribuyendo a estabilizar, volatilizar o extraer metales pesados de diferentes medios. Las especies vegetales empleadas poseen mecanismos innatos y adquiridos que les permiten soportar o concentrar altos niveles de metales tanto en la zona de sus raíces como en su estructura interna (Julca, 2022). Además, esta metodología se beneficia de la presencia de microorganismos en la rizosfera, la zona cercana a las raíces de las plantas, que colaboran en la extracción de los metales a través de la planta en cuestión (Vital, 2019). 32 Ventajas de la fitorremediación Según López et al., (2022) las ventajas que tiene la técnica de fitorremediación en suelos contaminados son las siguientes: • Es una tecnología amigable con el medio ambiente, puesto que no genera impactos negativos adicionales durante su utilización. • Está diseñada para intervenir en entornos con niveles contaminantes bajos o moderados. • Su aplicación es versátil, pudiendo emplearse en cuerpos de agua, suelos o aire. • No exige personal altamente capacitado para su operación, lo que facilita su implementación. • Es una alternativa económica tanto en su instalación como en su mantenimiento. • Permite la recuperación de materiales como el agua, la biomasa y los metales. • Por sus buenos resultados es una solución bien aceptada por las comunidades. Técnicas de fitorremediación Montenegro et al. (2020) indica que la técnica de fitorremediación comprende diferentes tecnologías enfocadas a la remediar contaminantes presentes en recursos como agua o suelos. Rizofiltración. Es una tecnología empleada principalmente para remediar agua contaminada con metales pesados como Pb, Cr, Ni, Cd, Cu y V. Utiliza plantas hiperacumuladoras para absorber los metales del agua a través las raíces (Montenegro et al., 2020). Fitoestabilización. La función de las plantas es transformar aquellas sustancias toxicas en un producto cuyas características no afecten en gran proporción al medio ambiente (Maiti y Kusmar, 2016). Fitovolatilización. se refiere al proceso en el cual las plantas absorben contaminantes presentes en el agua, e incluso pueden transportarlos hasta sus hojas (Papuico, 2022). 33 Fitoextracción. Es una tecnología principalmente utilizada para remover concentraciones elevadas de Pb, Cr, Ni, Cd, Cu y V cuyas concentraciones son elevadas en el suelo. Las plantas absorben y acumulan los contaminantes en sus diferentes partes como hojas, tallos o raíces, que luego se cosechan (Montenegro et al., 2020). Fitodegradación. Degradación enzimática de contaminantes orgánicos e inorgánicos en el interior de la planta (Cerrón, 2022). 1.2.4. Girasol El H. annuus es una especie vegetal de la familia Asterácea. Presenta un tallo recto y grueso, hojas anchas, ovaladas, cubiertas con un recubrimiento piloso, mientras que la flor tiene una estructura que consta de un núcleo de color café rodeado por pétalos de tonalidad amarilla (Reategui y Reátegui, 2018). Su principal característica es su capacidad de absorción de metales pesados (Julca, 2022). Taxonomía Según Trópicos (2023) la clasificación taxonómica del H. annuus que se presenta en la Tabla 2 es la siguiente: Tabla 2 Clasificación taxonómica Descripción Clasificación Orden Esterales Familia Asteraceae Género Helianthus Nombre científico de la especie H. annuus L. Nota. Elaboración propia a partir de Trópicos (2023). Conectando el mundo de los botánicos desde 1982. Jardín Botánico Missouri. https://www.tropicos.org/name/1700194 34 1.2.5. Lombriz Eisenia foetida Según Arias (2022) la E. foetida, conocida como lombriz roja californiana, es una especie que se encuentra ampliamente en todo el mundo y es especialmente conocida por su papel en el tratamiento de materia orgánica. A continuación, se detalla información relevante sobre esta especie: Características físicas La E. foetida es una lombriz de tamaño mediano, generalmente mide de 7 a 8 centímetros de largo. Tiene un color rojo, con un cuerpo segmentado y anillos que le permiten moverse de manera eficiente a través del sustrato (Bancayan y Cisneros, 2022). Hábitat La E. foetida se desarrolla en sustratos aireados con concentraciones de oxígeno de entre 55 y 65 %, con buen escurrimiento de agua, temperaturas moderadas que fluctúan entre los 20 °C y 32 °C, altos niveles de humedad (80 a 85 %) y un pH del suelo que oscila entre 5 y 9 (Mantuano y Zambrano, 2023). Se puede encontrar en sustratos orgánicos ricos en materia descompuesta, como compost, estiércol y hojas (Bancayan y Cisneros, 2022). Comportamiento alimenticio La E. foetida es conocida por ser un consumidor voraz de materia orgánica en procesamiento. Se alimenta de restos de alimentos, residuos de jardín y otros materiales orgánicos en análisis. Sus excrementos, conocidos como "vermicompost", son muy ricos en nutrientes y se utilizan comúnmente como fertilizante orgánico (Ataucasi y Bellido, 2022). Reproducción La E. foetida es hermafrodita, lo que significa que tiene órganos reproductores tanto masculinos como femeninos. Su reproducción puede ocurrir hasta cinco veces por semana, generando cápsulas con entre dos y cuatro embriones en cada ocasión. Cada individuo puede llegar a producir hasta 1 500 descendientes (González y Arias, 2018). 35 Beneficios para el medio ambiente E. foetida es una especie beneficiosas para el medio ambiente y la agricultura. Su capacidad para descomponer materia orgánica contribuye a la formación de suelos fértiles y reduce la cantidad de residuos orgánicos en vertederos, lo que a su vez ayuda a reducir la producción de gases de efecto invernadero (Ataucasi y Bellido, 2022). Taxonomía Según Juárez (2010) la lombriz E. foetida presenta la siguiente clasificación taxonómica (Tabla 3). Tabla 3 Clasificación taxonómica Descripción Clasificación Orden Opistoporo Familia Lombricidae Género Eisenia Especie E. foetida Nota. Elaboración propia a partir de Juárez (2010). Reciclaje de lodos residuales de la industria del papel mediante lombricultura utilizando la especie E. foetida. Repositorio de la Universidad Nacional Agraria La Molina. https://hdl.handle.net/20.500.12996/1658 Humus de lombriz E. foetida Según Almerco et al. (2024), el humus de lombriz es un abono orgánico empleado en la recuperación de suelos afectados por metales pesados. Mejora la estructura y propiedades fisicoquímicas del suelo, favoreciendo tanto la germinación como el desarrollo de diversos cultivos. Este abono posee gran cantidad de nutrientes y es de muy baja densidad (Ataucasi y Bellido, 2022). El humus de lombriz se obtiene a partir de la degradación de los restos de materia orgánica con la ayuda de microrganismos y de lombrices que se alimentan de ellos, para empezar a transformarlos a través de su proceso digestivo en su defecación (heces) dando como resultado el humus de lombriz (Bancayan y Cisneros, 2022). 36 1.2.6. Simbiosis Según Ochoa (2020), este término se interpreta como vivir juntos, además, describe una asociación donde están involucrados dos especies, es decir, la convivencia de organismos con nombres diferentes, considerando criterios como hábitat, tamaño, necesidad, nutrición etc. 37 CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Diseño de la investigación Se optó por un diseño experimental, debido a que se manipularon intencionalmente diferentes cantidades de semillas de H.annuus y porcentajes de humus de E. foetida en cada uno de los tratamientos, con el objetivo de identificar el tratamiento óptimo para la biorremediación de suelos contaminados con plomo (Arias y Covinos, 2021). Asimismo, la investigación presentó un enfoque cuantitativo, al basarse en la recolección de datos numéricos sobre la concentración de plomo (Pb) en el suelo y en las plantas, así como en la aplicación de análisis estadísticos para contrastar la hipótesis planteada (Hernández et al., 2014). Por otro lado, el estudio tuvo un alcance descriptivo, explicativo y aplicativo: • Descriptivo, porque se caracterizaron propiedades del suelo y de H. annuus, como el pH, conductividad, temperatura, humedad, altura de la planta y crecimiento radicular. • Explicativo, porque se analizó la relación causa-efecto entre el uso del girasol en simbiosis con el humus de lombriz y la reducción de plomo (Pb) en el suelo. • Aplicativo, porque se buscó aplicar esta combinación como una estrategia práctica de biorremediación, con miras a su implementación futura en suelos (Gallardo, 2017). 2.2. Lugar y fecha La investigación se ejecutó en la región Piura, específicamente en el distrito de La Matanza, caserío Cruz Verde, Mz. F, lote N.º 08 (Figura 1), donde se llevaron a cabo los tratamientos experimentales en condiciones controladas de campo. El estudio tuvo una duración de cuatro meses, iniciando en febrero y concluyendo en junio del año 2024. Las muestras de suelo contaminado fueron recolectadas el día 25 de febrero de 2024 en la ex mina Turmalina, ubicada en el distrito de Canchaque, provincia de Huancabamba, región Piura (Figura 2). Posteriormente, los análisis fisicoquímicos del suelo y los análisis de acumulación de plomo (Pb) en las plantas de H. annuus fueron realizados en el laboratorio “Laboratorios RCJ LABS Universal”, ubicado en carretera central KM 8.9 N° 525 - San 38 Agustín de Cajas, Huancayo, cumpliendo con los protocolos establecidos para el análisis de metales pesados. La selección de este laboratorio respondió a un criterio técnico fundamental: la disponibilidad y operatividad del método analítico de espectrometría de absorción atómica (AAS), requerido para cuantificar con alta precisión los niveles de plomo presentes en las muestras. Durante la etapa de planificación del estudio, se evaluaron opciones de análisis en la región de Piura, donde se realizó la investigación. Sin embargo, se constató que los laboratorios locales no contaban con espectrofotómetro de absorción atómica ni con los protocolos validados por la normativa ambiental peruana (ECA Suelo) para la determinación de metales pesados. En cambio, el laboratorio RCJ LABS Universal cuenta con certificación de procedimientos y equipos calibrados para análisis ambientales, garantizando resultados confiables y trazables. Por tanto, la elección de este laboratorio se fundamentó en la necesidad de asegurar la validez técnica y científica de los datos generados, en cumplimiento con los estándares exigidos para investigaciones ambientales que involucran contaminantes inorgánicos como el plomo. 39 Figura 1 Mapa de ubicación del área donde se ejecutó el experimento Nota. Mapa de ubicación elaborado con Arcgis 10.0. Figura 2 Mapa de ubicación de los puntos de muestreo Nota. Mapa de ubicación elaborado con Arcgis 10.0. 40 2.3. Descripción del experimento 2.3.1. Caracterizar las propiedades del suelo (pH, temperatura, conductividad eléctrica y humedad), y la concentración de plomo inicial La caracterización del suelo se llevó a cabo mediante la recolección de muestras en la ex mina Turmalina, ubicada en el distrito de Canchaque, provincia de Huancabamba, región Piura. Esta área fue seleccionada debido a antecedentes de contaminación por residuos mineros. Las muestras fueron tomadas mediante un muestreo en zigzag en cinco puntos representativos, a 60 cm de profundidad, conforme a los lineamientos del MINAM (2014). Luego, fueron transportadas a un laboratorio acreditado para realizar los análisis fisicoquímicos y de metales pesados, donde se determinó el pH, temperatura, conductividad eléctrica, humedad y la concentración inicial de plomo. Esta información permitió establecer la condición inicial del sustrato antes de aplicar cualquier tratamiento. 2.3.2. Estudiar algunas de las propiedades fisicoquímicas de H. annuus (altura de la planta, crecimiento de raíz, cantidad de hojas y concentración final de Pb) y del sustrato experimental (NPK, textura, capacidad de intercambio catiónico, conductividad eléctrica y pH) de los tratamientos La fase experimental se llevó a cabo en el distrito de La Matanza, provincia de Morropón, región Piura, en condiciones controladas de campo. Se empleó un diseño experimental bifactorial que consideró tres niveles de aplicación de humus de E. foetida (25 %, 50 % y 75 %) y tres cantidades de semillas de H. annuus (3, 5 y 7 unidades por maceta). Cada combinación se replicó tres veces, totalizando 27 unidades experimentales. Durante el desarrollo del cultivo, se monitorearon variables morfológicas del H. annuus, como altura, número de hojas, diámetro del tallo y longitud de raíces. Asimismo, al finalizar el periodo experimental, se recolectaron muestras del sustrato para evaluar sus propiedades fisicoquímicas: contenido de nitrógeno, fósforo y potasio (NPK), textura, capacidad de intercambio catiónico, pH y conductividad eléctrica, con el fin de determinar las modificaciones atribuibles a los tratamientos aplicados. 41 2.3.3. Evaluar la eficiencia de la biorremediación del suelo contaminado con Pb empleando H. annuus y humus de E. foetida de los tratamientos en estudio La eficiencia de la biorremediación fue analizada mediante el seguimiento a la concentración de plomo en el suelo antes y después de la aplicación de cada tratamiento, así como la evaluación de la acumulación del metal en diferentes partes de la planta (H. annuus). Para ello, se utilizaron métodos de análisis instrumental, específicamente espectrofotometría de absorción atómica en laboratorio. Se aplicó un análisis estadístico basado en ANOVA bifactorial y pruebas de comparación de medias, lo que permitió identificar la influencia individual y conjunta de los factores (número de semillas y porcentaje de humus) sobre la eficiencia de remoción del contaminante. 2.3.4. Determinar el porcentaje de reducción de Pb que tiene el suelo del tratamiento con mayor efectividad de biorremediación Una vez culminada la etapa experimental y recopilados los datos, se procedió a comparar los tratamientos mediante análisis estadísticos y criterios de eficiencia en la remoción del plomo del suelo. Para ello, se calculó el porcentaje de reducción del metal con base en los valores iniciales y finales de concentración. Esta comparación permitió identificar el tratamiento más efectivo, sustentando así la validación técnica del uso combinado de H. annuus y humus de lombriz roja como alternativa sostenible para la recuperación de suelos impactados por metales pesados. Con el propósito de brindar mayor claridad al proceso metodológico, la investigación estructuró un diagrama de operaciones (Figura 3) que resume de forma esquemática las principales actividades desarrolladas. Asimismo, se describieron detalladamente las fases ejecutadas durante el estudio, abarcando desde la recolección de muestras hasta el análisis e interpretación de resultados, garantizando así un enfoque sistemático y riguroso en cada etapa del trabajo experimental. 42 Figura 3 Diagrama de operaciones NO SI Recojo de muestras Acopio de insumos y materiales Desarrollo de pruebas de germinación ¿Germinaron las semillas? Desarrollo de la investigación e incorporación de tratamientos Evaluaciones en suelo y H. annuus Envío de muestras a laboratorio Análisis de resultados de laboratorio de las muestras: suelo, tallo, hojas, raíces Análisis de datos Interpretación, discusión de resultados Presentación de informe final 43 2.3.5. Fase de muestreo Muestreo de suelo contaminado Las muestras de suelo contaminado con plomo fueron recolectadas en la ex mina Turmalina, ubicada en el distrito de Canchaque, provincia de Huancabamba, región Piura. El área total muestreada fue de 200 m², delimitando previamente el terreno con base a la investigación de Zapata (2019), además las características superficiales visibles como colores, presencia de residuos metálicos, y escasa cobertura vegetal. Se aplicó un muestreo en zigzag, siguiendo la metodología descrita por Cerrón (2022), con modificaciones basadas en el protocolo de muestreo por emergencia ambiental del Ministerio del Ambiente (MINAM, 2014). En este protocolo se recomienda el muestreo sistemático en áreas con sospecha de contaminación por metales pesados. Se establecieron cinco puntos de muestreo (Figura 4), distribuidos equidistantemente a 10 m entre sí, cubriendo toda la superficie seleccionada de forma representativa como lo establece la Guía para el muestreo de suelos del MINAM (2014). En cada punto se excavó una calicata de 60 cm de profundidad cumpliendo con el protocolo de muestreo del MINAM (2014) que establece la profundidad de una calicata para muestreo en un rango de 0 a 100 cm, y se extrajo una muestra compuesta de aproximadamente 1 kg de suelo, que se almacenó en bolsas plásticas rotuladas, limpias y estériles. Figura 4 Localización de puntos de muestro del terreno del suelo contaminado 44 La presencia de plomo en la zona se justificó por antecedentes históricos de explotación minera en la ex mina Turmalina, los cuales han sido documentados en investigaciones como la de Zapata (2019) “Contenido de metales pesados en vegetación alrededor de una mina cerrada en la región Piura” y la de Bech et al., (1997) “Arsenic and heavy metal contamination of soil and vegetation around a copper mine in northern Peru”. Asimismo, los residentes locales reportan afectación al suelo y cultivos. Sin embargo, para confirmar la contaminación, se procedió al análisis de las muestras en laboratorio. Las muestras en el laboratorio fueron analizadas para determinar presencia y concentración de metales pesados con la técnica de espectrofotometría, utilizando un espectrofotómetro de absorción atómica. Previamente, las muestras pasaron por un proceso de digestión ácida húmeda, utilizando una mezcla de ácido nítrico (HNO₃) y ácido clorhídrico (HCl) (Zapata, 2019). Los puntos de muestreo y sus coordenadas consideradas en la investigación se detallan dentro de la Tabla 4. Tabla 4 Descripción de los puntos de muestreo según coordenadas Puntos de muestreo Coordenadas M1 -5.365476, -79.569423 M2 -5.365458, -79.569676 M3 -5.365609, -79.569551 M4 -5.365205, -79.569377 M5 -5.365442, -79.569176 45 Cadena de custodia de las muestras de la investigación Para garantizar la integridad de las muestras durante el traslado desde la ex mina Turmalina, (lugar donde se tomaron las muestras) ubicada en el distrito de Canchaque, hacia la zona experimental en el distrito de La Matanza, ambos en la región Piura, con un trayecto estimado de 3 horas por vía terrestre, se utilizaron bolsas plásticas estériles, rotuladas con código, punto de muestreo, fecha y hora, selladas herméticamente para evitar contaminación cruzada. Las bolsas fueron colocadas dentro de contenedores térmicos tipo cooler, para mantener condiciones ambientales estables (temperatura fresca y sin exposición solar directa) durante el trayecto. Una vez culminada la fase experimental en La Matanza, se procedió al traslado de las muestras al laboratorio “RCJ LABS Universal”, ubicado en el distrito de San Agustín de Cajas, Huancayo, región Junín, con un tiempo estimado de 20 horas de recorrido terrestre. Durante este trayecto, las muestras fueron custodiadas bajo protocolo de trazabilidad, manteniéndose en los mismos coolers térmicos con refrigeración pasiva, protegidas de impactos físicos, humedad externa y cambios bruscos de temperatura. Se utilizó un registro de transporte que incluyó datos como: lugar y hora de salida, nombre del responsable, puntos de parada, fecha y hora de llegada al laboratorio, y firma de recepción técnica. Este procedimiento de doble custodia (de campo a fase experimental y de fase experimental al laboratorio) garantizó la integridad físico-química de las muestras para su posterior análisis. Todo el manejo se realizó en cumplimiento con la Guía de muestreo de suelos del MINAM (2014) y buenas prácticas de laboratorio para estudios ambientales. 46 2.3.6. Fase experimental y laboratorio Recolección de la materia prima Las semillas de H. annuus y el humus de E. foetida fueron obtenidos de un lote certificado proporcionado por la Universidad Nacional de Piura. Ambos insumos fueron seleccionados considerando criterios de pureza, calidad y viabilidad, factores determinantes para garantizar el éxito experimental de la investigación. Con este propósito, se adquirió 45 unidades de semillas y 4,5 kg de humus de alta calidad. Siembra de semillas de H. annuus Las semillas de H. annuus fueron sembradas en el suelo extraído de las cinco calicatas recolectadas en la ex mina Turmalina, mezclado con humus de lombriz en diferentes proporciones. Se emplearon bolsas plásticas de almacigo de 20 cm de ancho y 30 cm de altura, con capacidad para contener aproximadamente 1,5 kg de suelo. En cada bolsa almaciguera se sembraron las semillas de H. annuus. Los tratamientos experimentales consistieron en tres proporciones diferentes de humus de lombriz (25 %, 50 % y 75 %) mezclado homogéneamente con el suelo contaminado y tres cantidades de semillas 3, 5 y 7 (Espiritu y Guerrero, 2022). La investigación contó con un diseño bifactorial (A y B) con tres niveles: Factor A (SG): Semillas de H. annuus (tres, cinco y siete semillas por macetero); Factor B (HL): Humus de lombriz (25, 50 y 75 %) (Tabla 5). Tabla 5 Factores de la investigación Semillas de H. annuus 25 % (HL1) 50 % (HL2) 75 % (HL3) 3 semillas (SG1) SG1_HL1 SG1_HL2 SG1_HL3 5 semillas (SG2) SG2_HL1 SG2_HL2 SG2_HL3 7 semillas (SG3) SG3_HL1 SG3_HL2 SG3_HL3 Nota. La tabla muestra los factores de investigación que se tuvieron en cuenta en la fase de experimentación de la investigación. Elaboración propia. 47 Se realizaron tres repeticiones por tratamiento, para un total de 27 unidades. Se respetó una distancia de siembra de entre 2 a 4 cm entre semillas dentro de la bolsa almaciguera. Posterior a la germinación del H. annuus se mantuvo el cultivo durante dos meses hasta que la planta inició su etapa de botón floral que va de los 55 a 70 días (Puttha et al., 2023). Las plantas se regaron cada dos días con 500 ml por bolsa los primeros 8 días, luego con 1 l con el mismo periodo (Mejía y Sebastián, 2019). Evaluación fisicoquímica del suelo y plantas de H. annuus Después de dos meses de cultivo, se realizaron mediciones de los parámetros fisicoquímicos del suelo contaminado, específicamente pH, conductividad eléctrica (CE), nitrógeno (N), potasio (K) y fósforo (P) en las instalaciones del laboratorio en Huancayo. La medición de pH se efectuó mediante un potenciómetro calibrado a través de una solución tampón de pH 4 y 7, para conocer los valore de la conductividad eléctrica se utilizó un conductímetro calibrado con un tampón de solución salina (Jaulis et al., 2024). La concentración de NPK se determinó aplicando los métodos de Nitrógeno espectrometría fosforo espectrometría y potasio (Bechlin, et al., 2014). Para la determinación de la concentración de plomo (Pb) en el suelo y en las plantas se utilizó la técnica de espectrometría de absorción atómica (AAS), empleando un espectrofotómetro de absorción atómica (Zapata, 2019). La espectrometría de absorción atómica consiste en la medición de la cantidad de luz absorbida por los átomos de un elemento específico (en este caso, plomo) cuando estos son excitados por una fuente de radiación (Uriña, 2022). 2.3.7. Fase de gabinete Durante esta fase se compararon los resultados obtenidos en los tratamientos para determinar el tratamiento mediante el cual se obtuvo mayor porcentaje en reducción de plomo. Asimismo, los resultados de los tratamientos fueron analizados estadísticamente utilizando el software IBM SPSS Statistics. 48 2.4. Tratamientos En la Tabla 6 se muestran el total de tratamientos utilizados para desarrollar la investigación. En la fase experimental, se codificaron los nueve tratamientos junto con sus respectivas tres repeticiones, las cuales fueron consideradas en el desarrollo de la investigación (Tabla 7). Tabla 6 Tratamientos de la investigación. Tratamientos Humus de lombriz (%) Semillas de H. annuus (Unid.) T1 25 3 T2 50 3 T3 75 3 T4 25 5 T5 50 5 T6 75 5 T7 25 7 T8 50 7 T9 75 7 Tabla 7 Codificación de los tratamientos de la investigación con sus repeticiones Codificación de las muestras Descripción de tratamientos Repeticiones SG1_HL1 (T1) 3 semillas + 25% humus R_1 R_2 R_3 SG1_HL2 (T2) 3 semillas + 50% humus R_1 R_2 R_3 SG1_HL3 (T3) 3 semillas + 75% humus R_1 R_2 R_3 SG2_HL1 (T4) 5 semillas + 25% humus R_1 R_2 R_3 SG2_HL2 (T5) 5 semillas + 50% humus R_1 R_2 R_3 SG2_HL3 (T6) 5 semillas + 75% humus R_1 R_2 R_3 SG3_HL1 (T7) 7 semillas + 25% humus R_1 R_2 R_3 SG3_HL2 (T8) 7 semillas + 50% humus R_1 R_2 R_3 SG3_HL3 (T9) 7 semillas + 75% humus R_1 R_2 R_3 49 2.5. Unidades experimentales Se trabajó con 27 unidades experimentales, las cuales estuvieron compuestas por macetas contenidas de 1 kg de suelo contaminado. Teniendo en cuenta que la investigación tuvo un diseño bifactorial, con nueve tratamientos y tres repeticiones. Todas las unidades experimentales fueron debidamente rotuladas y situadas en un ambiente adecuado para garantizar su correcto desarrollo. 2.6. Identificación de las variables y su mensuración Las variables consideradas en el presente estudio se detallan en la Tabla 8. Tabla 8 Variables de la investigación Variable Unidad de medida Método Tamaño cm Toma de medidas con wincha Crecimiento de raíz cm Toma de medidas con wincha Cantidad de hojas - conteo NPK del humus % Nitrógeno espectrometría fosforo espectrometría y potasio Conductividad eléctrica del humus uS/cm se utilizó un conductímetro calibrado con un tampón de solución salina pH del humus 0- 14 La medición de pH se efectuó mediante un potenciómetro Humedad % Gravimetría Tipo de suelo limoso, franco y arenoso Método hidrométrico (análisis de textura de suelo) pH del suelo 0 -14 La medición de pH se efectuó mediante un potenciómetro Conductividad eléctrica del suelo uS/cm se utilizó un conductímetro calibrado con un tampón de solución salina N, P, K en el suelo % Nitrógeno espectrometría fosforo espectrometría y potasio Capacidad de Intercambio Catiónico meq/100 g el método de acetato de amonio 1N a pH 7,0 Plomo inicial y plomo final mg·kg⁻¹ Se compararon los resultados iniciales y finales de porcentaje de Pb para estimar la reducción del metal. 50 2.7. Diseño estadístico del experimento El experimento se planteó bajo un Diseño en Bloques Completamente al Azar (DBCA) con un arreglo bifactorial, donde se evaluaron dos factores principales: • Factor A: Porcentaje de humus de lombriz (25 %, 50 %, 75 %) • Factor B: Número de semillas sembradas por macetero (3, 5 y 7 semillas) Cada combinación de tratamientos fue asignada aleatoriamente dentro de bloques homogéneos para reducir la variabilidad experimental no controlada. La ecuación matemática que representa el modelo utilizado es la siguiente (Sánchez, 2020): 𝑌𝑖𝑗𝑘 = 𝜇 + 𝛼𝑖 + 𝛽𝑗 + (𝛼𝛽)𝑖𝑗 + 𝑒𝑖𝑗𝑘 Donde: 𝑌𝑖𝑗𝑘 = Valor observado de la variable dependiente (por ejemplo, concentración de Pb, altura de planta) en el tratamiento con el i-ésimo nivel de humus y el j-ésimo número de semillas en el k-ésimo bloque. 𝜇 = Media general del experimento. 𝛼𝑖 = Efecto del i-ésimo nivel del porcentaje de humus. 𝛽𝑗 = Efecto del j-ésimo nivel del número de semillas. (𝛼𝛽)𝑖𝑗 = Efecto de la interacción entre el i-ésimo nivel de porcentaje de humus y el j-ésimo nivel número de semillas. 𝑒𝑖𝑗𝑘 = Error aleatorio El análisis de datos se realizó mediante un Análisis de Varianza (ANOVA) bifactorial, seguido de una prueba de comparación múltiple de medias (Tukey al 5 % de significancia), para identificar diferencias significativas entre tratamientos. 51 2.8. Análisis estadístico de los datos Se empleó el Análisis de Varianza (ANOVA) para determinar si existían diferencias significativas entre los tratamientos, considerando variables como la concentración de Pb en el suelo, altura de plantas, entre otras. Previamente, se verificaron los supuestos necesarios para aplicar ANOVA: • Normalidad de los datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk, para corroborar que los datos siguen una distribución normal (Luzuriaga et al., 2023). • Homogeneidad de varianzas mediante la prueba de Bartlett, que permite comprobar la significancia estadística (Marca, 2024). Una vez cumplidos estos supuestos, se aplicó el ANOVA bifactorial para identificar diferencias entre los tratamientos. Posteriormente, se utilizó la prueba de comparación múltiple de Tukey con un nivel de confianza del 95 % (p ≤ 0,05), con el fin de comparar las medias y establecer qué tratamientos presentaron diferencias significativas. El procesamiento de los datos se realizó utilizando el software IBM SPSS Statistics versión 21. Adicionalmente, los resultados gráficos complementarios fueron elaborados en Microsoft Excel para una mejor visualización de las tendencias observadas. 2.9. Materiales y equipos En esta investigación se utilizaron las siguientes técnicas e instrumentos de recolección de datos, orientados a obtener información cuantitativa sobre las propiedades del suelo, la planta y la concentración de plomo (Pb). Técnicas de recolección de datos Las principales técnicas que se emplearon en la investigación para la recolección de datos fueron: 52 • Observación directa. Para registrar el crecimiento de las plantas, el número de hojas, y las condiciones generales de los tratamientos. • Muestreo experimental. Se tomaron muestras de suelo y tejido vegetal de forma controlada y sistemática, en función de los tratamientos establecidos. • Medición instrumental. Se midieron parámetros fisicoquímicos del suelo y del agua como pH, temperatura, conductividad eléctrica y humedad. • Análisis de laboratorio. Se realizaron análisis de concentración de Pb en suelos y tejidos vegetales mediante espectrofotometría de absorción atómica. Instrumentos de recolección de datos Los instrumentos que se utilizaron en la investigación para la recolección de datos fueron los siguientes: • Conductímetro. Para medir la conductividad eléctrica del suelo y del agua. • pH metro y equipo multiparámetro. Para registrar el pH, temperatura y otros parámetros del suelo y del agua. • Espectrofotómetro de absorción atómica. Para determinar la concentración de plomo (Pb) en muestras de suelo y tejido vegetal. • Cinta métrica y regla. Para medir la altura de las plantas y longitud de raíces. • GPS. Para georreferenciar el lugar de muestreo. • Muestreador de suelos y palanas. Para la extracción de muestras de suelo. • Regadera y baldes. Para el manejo del riego en cada tratamiento. • Maseteros. Como unidades experimentales para contener los tratamientos. • Libreta de campo, cámara fotográfica, lapiceros y marcadores. Para registrar observaciones, tomar evidencia visual y anotar datos durante el experimento. 53 Los materiales y equipos empleados para ejecutar la investigación se detallan en la Tabla 9. Tabla 9 Materiales y equipos utilizados en la investigación Concepto Cantidad Agua destilada (L) 8 Balanza digital (unid.) 1 Baldes (unid.) 5 Bolsa ziploc (unid.) 100 Bolsa de polietileno (unid.) 1 Botas (unid.) 2 Cámara fotográfica (unid.) 3 Cinta métrica (unid.) 2 Conductímetro (unid.) 1 Cooler (unid.) 2 Cuchillo de cocina (unid.) 2 Equipo multiparámetro (unid.) 1 Espectrofotómetro de absorción atómica (día) 3 GPS (día) 2 Guantes (Par) 8 Guardapolvo (unid.) 2 Humus de E. foetida (kg) 10 Lapicero (unid.) 4 Libreta de campo (unid.) 3 Marcadores (unid.) 4 Maseteros (unid.) 20 Mortero (unid.) 2 Muestreador de suelos (unid.) 1 Palanas (kg) 2 pH metro (unid.) 1 Picos (unid.) 2 Recipiente plástico de 20 L (unid.) 3 Regadera (unid.) 2 Semillas de H. annuus (kg) 7 Tamiz (unid.) 2 54 CAPÍTULO III: RESULTADOS 3.1. Caracterizar las propiedades del suelo (pH, temperatura, conductividad eléctrica y humedad) y concentración de plomo inicial Previo a iniciar con los tratamientos experimentales, se realizó el análisis de las propiedades fisicoquímicas del suelo y del humus de lombriz, cuyos resultados se detallan en la Tabla 10. El suelo agrícola presentó una concentración de plomo elevada (268,421 mg·kg⁻¹), un pH ácido (5,01), conductividad eléctrica baja (283 µS/cm). En cuanto al humus de lombriz, se registró una menor concentración de plomo (34,775 mg·kg⁻¹), pH alcalino (7,50), conductividad eléctrica alta (1785 µS/cm) y mayor contenido de humedad (56,16 %). Estos fueron esenciales para el desarrollo del experimento. Tabla 10 Análisis de las propiedades del suelo antes de los tratamientos Unidad Pb (mg·kg⁻¹) pH T (°C) CE (µS/cm) Humedad (%) Límite de cuantificación 0,001 0 –14 -5 – 55 0 – 2000 0 – 100 M-humus-lombriz 34,775 7,50 17° 1785 56,16 M-suelo-agrícola 268,421 5,01 18° 283 21,86 3.2. Estudiar algunas de las propiedades fisicoquímicas de H. annuus y suelo experimental de los tratamientos en estudio 3.2.1. Propiedades fisicoquímicas de H. annuus La Tabla 11 expone los resultados de cada uno de los tratamientos con respecto las propiedades fisicoquímicas del H. annuus, cantidad de hojas, diámetro, altura, tamaño de raíz. Los tratamientos con mejores propiedades fisicoquímicas del H. annuus fueron, el tratamiento T3 (cantidad de hojas: 24,89; diámetro: 0,68; altura: 88,00; tamaño de raíz: 21,17) y T2 (cantidad de hojas: 25,65; diámetro: 0,63; altura: 85,56; tamaño de raíz: 15,39). 55 Tabla 11 Propiedades fisicoquímicas del H. annuus Tratamientos Cantidad de hojas Diámetro (cm) Altura (cm) Tamaño de raíz (cm) T1 20,56 0,46 71,56 12,22 T2 25,67 0,63 85,56 15,39 T3 24,89 0,68 88,00 21,17 T4 19,27 0,39 62,27 11,70 T5 22,93 0,54 81,73 14,67 T6 23,33 0,55 81,33 17,06 T7 16,67 0,35 55,86 8,02 T8 20,76 0,40 58,38 8,90 T9 20,90 0,48 64,38 12,05 Los resultados de la concentración de plomo en las plantas de H. annuus se muestran en la Tabla 12, donde se observa que el tratamiento T7 presentó la mayor concentración promedio de plomo en la planta completa (136,157 ppm), mientras que el tratamiento T6 registró la menor concentración (36,213 ppm). Estos valores permiten identificar las diferencias en la capacidad de acumulación de plomo entre los tratamientos evaluados. Tabla 12 Concentración de plomo final en las plantas Tratamientos Pb Tallo (mg·kg⁻¹) Pb Raíz (mg·kg⁻¹) Pb Hoja (mg·kg⁻¹) Pb_total (mg·kg⁻¹) T1 65,755 149,892 34,968 83,538 T2 43,278 149,212 30,331 74,274 T3 60,898 60,524 28,786 50,069 T4 28,650 185,894 21,033 78,526 T5 41,152 61,193 21,381 41,242 T6 49,935 47,048 20,657 39,213 T7 96,722 274,073 37,675 136,157 T8 76,641 121,661 33,054 77,119 T9 44,285 98,590 22,332 55,069 56 3.2.2. Propiedades fisicoquímicas del suelo experimental Capacidad de intercambio catiónico (CIC) La Tabla 13 muestra que los valores de esta propiedad varían desde 9,42 meq/100g en el tratamiento T7 como mínimo y 11,43 meq/100g en el tratamiento T9 como valor máximo. Tabla 13 Capacidad de intercambio catiónico (CIC) Tratamientos CIC meq/100g T1 9,63 T2 10,27 T3 11,04 T4 9,55 T5 10,20 T6 11,28 T7 9,42 T8 10,15 T9 11,43 Potencial de hidrógeno (pH) La Tabla 14 evidencian los valores de pH del suelo de los tratamientos. Estos valores de la propiedad oscilan en un rango de 5,66 en el tratamiento T1 como mínimo valor, hasta 6,45 en el tratamiento T3 como valor máximo. Tabla 14 Potencial de Hidrogeno (pH) Tratamientos pH (1:1) T1 5,66 T2 6,23 T3 6,45 T4 5,74 T5 6,10 T6 6,38 T7 5,67 T8 6,28 T9 6,43 57 Conductividad eléctrica (CE) La Tabla 15 presenta los valores de conductividad eléctrica de los tratamientos. Dichos valores varían desde 734,33 µS/cm en T1 a un máximo valor de 1056,67 µS/cm en T9. Tabla 15 Conductividad eléctrica (CE) Tratamientos CE (1:1) µS / cm T1 734,33 T2 900,33 T3 1038,00 T4 756,67 T5 906,67 T6 1023,33 T7 796,67 T8 932,33 T9 1056,67 3.2.3. Textura del suelo Los resultados obtenidos de los análisis de laboratorio sobre textura del suelo para cada tratamiento se detallan en la Tabla 16. Se evidencia que a excepción del tratamiento T1 y T2 en todos hubo predominancia de mayor porcentaje de arena. Llevando estos valores a un triángulo textural los resultados indicaron que el suelo en cada uno de los tratamientos tiene una textura franco arenoso. Tabla 16 Textura del suelo Tratamientos Arena (%) Limo (%) Arcilla (%) T1 40,67 46,33 13,00 T2 43,00 44,33 12,67 T3 44,67 42,67 12,67 T4 48,67 39,67 11,67 T5 47,67 40,00 12,33 T6 47,00 40,67 12,33 T7 50,00 39,67 10,33 T8 51,00 37,67 11,33 T9 52,33 38,00 9,67 58 3.2.4. Nutrientes del suelo N, P2O5, K2O La Tabla 17 se presentan los resultados de los nutrientes del suelo N, P2O5, K2O. El valor mínimo de N en el suelo fue de 0,11 que se encuentra en los tratamientos T1 y T4, mientras que el valor máximo fue de 0,37 en los tratamientos T6 y T9. El valor de P2O5 se estipula en un rango que va desde 0,11 encontrados en los tratamientos T1 y T4, hasta un valor máximo de 0,38 encontrado en los tratamientos T3 y T6. Por último, los valores de K2O varían desde 0,24 en el T1 a 0,74 en el T2 y T9 como valor mínimo y máximo respectivamente. Tabla 17 Nutrientes del suelo N, P2O5, K2O Tratamientos N (%) P2O5 (%) K2O (